LNP穩(wěn)定性

除了mRNA 的完整性外，LNP 的穩(wěn)定性對于 mRNA-LNP 疫苗的質量也至關重要。目前的mRNA疫苗沒有披露關于LNP 穩(wěn)定性測試的數(shù)據(jù)，但 Onpattro (patisaran) 的siRNA-LNP 制劑保存在2~8°C 之間時具有三年的有效期，同時該產品不能冷凍保存。

Onpattro 的LNP 系統(tǒng)的組成是：可電離的陽離子脂質DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇、PEG2000-C-DMG（見表 1）（摩爾比 50:10:38.5:1.5），它們在組成上類似于 Comirnaty 和 mRNA-1273的LNP。在一項siRNA-LNPs 的研究中用類脂質306O 13代替DLin-MC3-DMA，樣品水溶液在 2°C 、pH 7 的環(huán)境下下能穩(wěn)定儲存156 天，其粒徑和siRNA包封率沒有明顯變化。Suzuki 等人的補充研究表明 siRNA-LNP 能在 4°C 環(huán)境下穩(wěn)定儲存1.5?？傊?，這些數(shù)據(jù)都表明是mRNA 的不穩(wěn)定，而不是 LNP 的不穩(wěn)定，導致了當前mRNA-LNP疫苗的儲存條件嚴苛和保質期短。

Fan等人總結了脂質體和 LNP的穩(wěn)定性及其質量屬性。LNP 可以承受化學和物理不穩(wěn)定性，化學不穩(wěn)定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂質的降解。脂質氧化可能發(fā)生在不飽和脂肪酸部分（Comirnaty 和 mRNA-1273 不存在該問題）和膽固醇，氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基團存在雜質導致的結果。除此之外，氧化性雜質也可能導致包封的mRNA 氧化。脂質例如 DSPC 和可電離的陽離子脂質中的羧酸酯鍵容易受溫度和pH依賴性的水解的影響（圖 6）。

LNP 穩(wěn)定性的另一個關鍵因素是物理穩(wěn)定性，主要有三種類型的物理不穩(wěn)定性：包封的藥物的聚集、融合和泄漏。 LNP 在儲存和流通過程中容易發(fā)生 LNP 的聚集，所以為了增加穩(wěn)定性，LNP 中通常添加PEG化脂質，LNP微粒表面的PEG 分子可防止LNP 聚集。

另一種類型的物理不穩(wěn)定性主要由于mRNA 的泄漏，這主要影響包封產品的穩(wěn)定性。值得注意的是，包封率通常 > 90%，并且尚未報道過在儲存期間出現(xiàn)mRNA泄露（用RiboGreen監(jiān)測）的情況。未包封的mRNA（“裸露的mRNA"）幾乎不會被細胞攝??；而且它會迅速被降解，因此無法用于翻譯。

圖6 用于 mRNA-LNP疫苗BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273的脂質。

由于注射 mRNA-LNP疫苗時的超敏反應可能與PEG化脂質有關，因此，已經研究了防止聚集體形成的替代脂質。使用多聚肌氨酸修飾脂質能使脂質遞送系統(tǒng)更加穩(wěn)定，在防止LNP聚集的同時能夠減少超敏反應。但是目前仍然需要更多的實驗來確定這種 PEG化脂質替代品是否能真正的提高 mRNA 的穩(wěn)定性（例如不含過氧化物，注：目前使用的PEG脂質由于工藝原因，會有一定的過氧化物雜質，這會引起LNP中其他含有不飽和鍵的脂質和mRNA的氧化降解）。

分析 LNP 穩(wěn)定性

Fan 等人在前面提到的文章中對監(jiān)測 LNP 穩(wěn)定性的分析方法進行了專業(yè)評估。我們推薦感興趣的讀者可以查看相關文獻。

mRNA-LNP中哪個成分更不穩(wěn)定？

迄今為止，已有幾項研究考察了在儲存期間穩(wěn)定 mRNA 和穩(wěn)定 LNP 的方法。然而，兩者之中哪一個才是mRNA-LNP穩(wěn)定性的瓶頸？當mRNA-LNP 制劑未冷凍時，是mRNA 降解？還是 LNP 降解導致穩(wěn)定性問題？還是 mRNA 與 LNP 的組合？

與mRNA-LNP 系統(tǒng)相比，包封化學修飾且高度穩(wěn)定的siRNA 分子（例如 Onpattro）的LNP系統(tǒng)具有更長的有效期。這表明當前的穩(wěn)定性瓶頸不是 LNP，而是 mRNA。

迄今為止，公開資料還沒有披露關于 mRNA-LNP 制劑中 mRNA 和 LNP 完整性的研究報告。在研究存儲效果的少數(shù)研究中，例如 Zhang等人的研究，并沒有考察長期儲存的穩(wěn)定性。因此，我們將首先研究裸露的mRNA的長期穩(wěn)定性，但需要注意的是，這可能與包封在 LNP中的 mRNA 的穩(wěn)定性有所不同（見下文）。

在Pascolo等人的綜述中，裸露的mRNA的水溶液在無RNase的情況下只能在4°C下儲存幾天。這似乎符合目前對 mRNA 不穩(wěn)定性的看法。目前關于裸露的mRNA長期穩(wěn)定性的研究表明，mRNA 需要冷凍或干燥才能保持更長時間的穩(wěn)定。

Roesler等人2009年的研究表明，編碼熒光素酶的mRNA 在無RNA酶存在的條件下，分別以液體或凍干形式在室溫下儲存，表達效率分別在第8天和第16天開始出現(xiàn)降低，凍干輔料和凍干工藝方面未經優(yōu)化（見圖 7）。同時本研究無法得出關于2-8℃溫度下長期儲存穩(wěn)定性的結論，因為穩(wěn)定性研究只考察了32 天。

Wayment-Steele等人經過基于理論降解速率計算，預測 長度為4000 nt的mRNA在 pH 7.4 和5 °C 的條件下，存儲的半衰期為 941 天。他們注意到較長的mRNA序列，例如SAM，更容易發(fā)生水解。由于這是jin基于水解降解動力學的理論計算結果，可能會低估 了mRNA的實際降解速率，例如，當存在痕量RNase時，必須對 mRNA 的穩(wěn)定性進行更多研究才能知道m(xù)RNA實際存儲的穩(wěn)定性情況。

圖7 通過轉染BHK-21細胞中熒光素酶表達效率分析mRNA在水中的穩(wěn)定性

這些研究表明，在水溶液中 mRNA 可能不如 LNP 穩(wěn)定。然而，應該重申的是，這兩種成分的穩(wěn)定性考察結果可能與LNP包封mRNA 的情況不同。如前幾節(jié)所述，mRNA 與可電離的陽離子脂質、膽固醇和水一起位于 LNP 核內部（參見圖 4）。這意味著 mRNA 處于水性環(huán)境中，因此容易發(fā)生水解，其水解的機制可能與溶液中 mRNA水解 的機制相似。然而，另一方面，LNP 內的 mRNA 可能通過疏水、氫鍵和/或靜電相互作用被可電離的脂質包裹。在這種情況下，mRNA 可能比溶解在水溶液中的裸露的mRNA更穩(wěn)定。在沒有進一步研究的情況下，只能得出結論，mRNA 的不穩(wěn)定性導致了儲存條件苛刻。 

儲存條件不同的原因

當前 mRNA 疫苗的另一個有趣方面是，不同廠家疫苗報告的儲存溫度和相應的“有效期"差異很大：從 -80°C 到 2-8°C，從幾天到幾個月。是否因為mRNA 疫苗處的不同導致這種儲存條件的差異？又或者，儲存條件的差異是否與熱穩(wěn)定性測試結果相關或更可靠的方法有關？這些信息很重要，因為深入了解對穩(wěn)定性產生積極影響的因素可能是未來設計熱穩(wěn)定mRNA 疫苗的關鍵突破點。

Acuitas Therapeutics的執(zhí)行官Tom  Madden 曾經在采訪中表示，Moderna 和 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗可能具有相同的穩(wěn)定性。后者是否有可能使用更保守的方法來確保穩(wěn)定性？盡管如此，目前必須在 -60 至 -80 °C 之間儲存的Pfizer/BioNTech mRNA-LNP 疫苗很可能也在更高的溫度和冷藏條件下進行了穩(wěn)定性考察，正如CureVac 科學家所做的那樣。

此外，穩(wěn)定性測試中的分析技術在靈敏度上可能不同，驗收標準也可能不同。疫苗穩(wěn)定性研究報告的發(fā)布可能對這些疑問作出回答，對此進行比較研究會是很有趣的工作。